熒光-PCR法是通過(guò)熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標記跟蹤，實(shí)時(shí)在線(xiàn)監控反應過(guò)程。PCR擴增時(shí)加入一對引物和一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個(gè)報告熒光基團和一個(gè)淬滅熒光基團。探針完整時(shí)，淬滅基團抑制報告基團的熒光發(fā)射。剛開(kāi)始時(shí)，探針結合在DNA任意一條單鏈上，PCR擴增時(shí)，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，報告基團與淬滅基團發(fā)生分離，抑制作用被解除，從而熒光監測系統可接收到熒光信號。隨著(zhù)PCR反應的進(jìn)行，反應產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過(guò)熒光強度變化監測產(chǎn)物量的變化，結合相應的軟件對產(chǎn)物進(jìn)行分析進(jìn)而得到一條熒光擴增曲線(xiàn)。熒光擴增曲線(xiàn)分熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期三個(gè)階段。指數期的PCR產(chǎn)物量的對數值與起始模板量之間存在線(xiàn)性關(guān)系，因此我們選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析，計算出待測樣品初始模版的量。
熒光-PCR法的理論依據是什么？
特定的待擴增基因片段起始含量越大，則指數擴增過(guò)程越短，當擴增速率趨于穩定后，則無(wú)論原來(lái)樣品中起始模板含量多少，終擴增片段的含量通常是一樣的。理想的擴增結果：Y=X×2n；其中：Y代表擴增產(chǎn)物量，X代表PCR反應體中的原始模板數，n為擴增次數；理論上PCR擴增效率為100，PCR產(chǎn)物隨著(zhù)循環(huán)的進(jìn)行成指數增長(cháng)，但實(shí)際上DNA的每一次復制都不*，即每一次擴增中，模板不是呈2的倍增長(cháng)；實(shí)際應為：Y=X(1+E)n，其中：E代表擴增效率，E=參與復制的模板/總模板，通常E≤1，E在整個(gè)PCR擴增過(guò)程中不是固定不變的。通常X在1-105拷貝、循環(huán)次數n≤30時(shí)，E相對穩定，原始模板以相對固定的指數形式增加，適合定量分析，這也就是所謂的指數期；隨著(zhù)循環(huán)次數n的增加（＞30次），E值逐漸減少，Y呈非固定的指數形式增加，后進(jìn)入平臺期。
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更新時(shí)間：2021-04-08
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